PEMBUATAN VAKSIN PROTEIN REKOMBINAN DAN VAKSIN DNA PENYAKIT JEMBRANA - , Asmarani Kusumawati, dkk ([Yogyakarta] : Lembaga Penelitian, 2002)
Penyakit Jembrana merupakan penyakit akut pada sapi Bos javanicus yang mengakibatkan angka kematian tinggi. Penyakit ini disebabkan oleh suatu Lentivirus, dinamakan virus penyakit Jembrana atau Jembrana disease virus (JDV). Penyakit Jembrana sudah menyebar di berbagai kawasan di Indonesia dan juga di Australia. Vaksinasi merupakan satu-satunya jalan untuk mencegah penyebaran penyakit Jembrana. Sepengetahuan kami, vaksin yang effisien belum didapatkan. Tujuan pekerjaan penelitian kami ialah pembuatan vaksin dengan metodologi baru yang didasarkan pada teknik Rekayasa Genetika. Dua jenis vaksin akan kami buat : vaksin protein rekombinan dan vaksin DNA, didasarkan pada protein Jembrana GAG-CA dan ENV-TM. Metode penelitian dan hasil saat ini meliputi : isolasi virus dari jaringan limpa, isolasi RNA total dari jaringan, isolasi RNA dari virus, isolasi-amplifikasi gen GAG-CA dan gen ENV-TM dengan RT-PCR, kloning di plasmid pCR-2.1, preparasi plasmid rekombinan positip, isolasi-pemotongan dan purifikasi gen GAG-CA dan gen ENV-TM dari plasmid rekombinan, preparasi vektor ekspresi prokariot pGEX-2T, kloning gen GAG-CA dan ENV-TM dalam pGEX-2T, analisa klon. Hasil yang diperoleh : a) Isolasi RNA total dari jaringan dan isolasi RNA dari virus RNA total diisolasi dari limpa sapi penderita penyakit Jembrana dengan TRIZOL dan RNA viral dipurifikasi dari virus terisolasi dengan phenol-chloroform atau TRIZOL. Hasil analisa kedua jenis R NA dengan elektrophoresis pada gel agarose menunjukkan adanya band bermigrasi pada posisi sekitar 7.000 basa, menunjukkan bahwa RNA berasal dari virus Jembrana yang genomnya, satu RNA rantai tunggal, berpanjang 7.732 basa. b) Isolasi-amplifikasi gen subunit GAG-CA dan gen subunit ENV-TM Protein gag (3 subunit: ma, ca, nc) dan env (2 subunit: su, tm) merupakan antigen penting. Pada penelitian ini kami mengisolasi dan mengamplifikasi fragmen DNA GAG-CA (sekitar 0.7 kb) dan TM-ENV (sekitar 1.1 kb) dengan RT-PCR dari genom virus (RNA total dari jaringan atau RNA dari virus). Primer didesign dari data sequence, ditambah site enzim baru ditujukan untuk insersi tanpa penggeseran reading frame pada vektor ekspresi prokariot pGEX-2T dan vektor ekspresi eukariot pcDNA3.1. Ditambahkan pula kodon ATG yang diperlukan untuk inisiasi ekspresi dalam sistim eukariot. Gen GAG-CA akan dimasukkan kedalam site BamHI-EcoRI. Gen ENV-TM akan dimasukkan dalam site tunggal BamHI. Reaksi RT-PCR dilaksanakan menggunakan single step RT-PCR kit (Roche). Analisa hasil isolasi-amplifikasi menghasilkan fragmen DNA sesuai dengan panjangnya gen, ialah sekitar 0.7 kb untuk GAG-CA dan sekitar 1.1 kb untuk ENV-TM. Selesai reaksi RT-PCR ditambahkan reaksi dengan Taq DNA polymerase, diarahkan untuk mempertinggi penambahan single 3Â adenine overhang, untuk optimalisasi kloning dalam pCR2.1 menggunakan topoisomerase. c) Konstruksi pada plasmid pCR-2.1 dan pemotongan-isolasi gen untuk tahap lanjut Kloning pada plasmid pCR-2.1 menggunakan TOPO TA cloning kit. Berkat topoisomerase dan single 3Â adenine overhang yang berjajar dengan produk RT-PCR atau PCR, kloning hasil amplifikasi RT-PCR dapat dilaksanakan tanpa purifikasi atau digesti enzymatik sebelumnya. Metode ini juga memungkinkan insersi fragmen DNA asing (exogeneous) dengan effisiensi jauh lebih tinggi bila dibandingkan dengan metode klasik dengan DNA ligase. Kloning dan transfeksi dalam E. coli DH 5&#61537