Improvement of l-phenylalanine production in Escherichia coli by methabolic engineering - Mayura Thongchuang (Chulalongkorn University, 2011)
แอล-ฟีนิลอะลานิน (L-Phe) เป็นกรดอะมิโนจำเป็นชนิดหนึ่ง ใช้เป็นสารตั้งต้นในการผลิตสารสำคัญในทางการแพทย์ และอุตสาหกรรมอาหาร เช่น แอสปาร์แตม ความต้องการใช้แอสปาร์แตมที่เพิ่มมากขึ้นนำไปสู่การเพิ่มการผลิต L-Phe ในจุลชีพโดยเฉพาะอย่างยิ่งใน E. coli งานวิจัยนี้มีเป้าหมายในการใช้กระ บวนการวิศวกรรมเมแทบอลิซึมในการปรับปรุงการผลิต L-Phe จากกลีเซอรอล ได้ทำการโคลนยีนฟินิลอะลานินดีไฮโดรจิเนส (phedh) จาก Bacillus lentus เข้าสู่ E. coli BL21(DE3) โดยใช้ expression vector pRSFDuet-1 (pPheDH) เพื่อเพิ่มการสร้าง L-Phe จากฟีนิลไพรูเวทในขั้นตอนสุดท้ายของการสังเคราะห์ผลิตภัณฑ์ พบว่าการผลิต L-Phe โดยโคลน pPheDH ในอาหารที่มีแหล่งคาร์บอนเป็นกลีเซอรอลซึ่งเป็นผลพลอยได้จากการผลิตไบโอดีเซลมีข้อจำกัด ซึ่งอาจเกิดในขั้นตอนการขนส่งกลีเซอรอลเข้าสู่เซลล์ การส่ง L-Phe ออกนอกเซลล์ หรือการควบคุมในขั้นตอนต่าง ๆ ของการสังเคราะห์ L-Phe ดังนั้น จึงทำการ โคลนยีนต่าง ๆ ที่เข้ารหัสให้โปรตีนที่สำคัญในวิถีการสังเคราะห์ L-Phe การนำกลีเซอรอลเข้าเซลล์และการนำ L-Phe ออกจากเซลล์ร่วมกับยีน phedh ได้แก่ aroB, aroL, glpF, glpK, pheA, tktA และ yddG ซึ่งเข้ารหัสให้ 3-dehydroquinate synthase, shikimate kinase II, glycerol facilitator, glycerol kinase, chorismite mutase/prephenate dehydratase, transketolase และ aromatic amino acid exporter ตามลำดับ โดยโคลน pPTFBLY ซึ่งประกอบด้วยยีน phedh, tktA, glpF, aroB, aroL และ yddG มีอัตราการผลิต L-Phe สูงที่สุดคือ 3.36 มิลลิกรัมต่อลิตรต่อชั่วโมงซึ่งสูงกว่าที่ได้จากโคลน pPheDH ถึง 2.1 เท่าโดยความเข้มข้นของ L-Phe ที่ 240 ชั่วโมงหลังจากวัดค่าการดูดกลืนแสงที่ 600 นาโนเมตรได้ 0.6 เท่ากับ 429 มิลลิกรัมต่อลิตร เมื่อทำการเลี้ยงโคลน pPYF ในถังหมักขนาด 5 ลิตร (อุณหภูมิ 37°ซ อัตราการใช้อากาศ I ปริมาตรอาหารต่อนาที ความเร็วในการกวน 400 รอบ ต่อนาที) พบว่าในการหมักแบบกะผลิต L-Phe สูงสุดที่ 56 ชั่วโมงเท่ากับ 366 มิลลิกรัมต่อลิตร ส่วนในการหมักแบบกึ่งกะที่มีการเคิมกลีเซอรอลสองครั้ง ที่ 40 และ 60 ชั่วโมง ตามลำดับ พบว่าปริมาณ L-Phe สูงสุดเท่ากับ 445 มิลลิกรัมต่อลิตร การหมักแบบกึ่งกะโดยเติมกลีเซอรอลครั้งเดียวที่ 40 ชั่วโมงได้ปริมาณ L-Phe สูงสุดเท่ากับ 545 มิลลิกรัมต่อลิตร ดังนั้นโคลน pPYF ให้ปริมาณ L-Phe เมื่อทำการผลิตในระดับถังหมักสูงกว่าการผลืตในระดับขวดเขย่าประมาณ 2.0 เท่า