Transformation of green fluorescent protein reporter gene into rice Oryza sativa cv. KDML 105 by co-cultivation with agrobacterium - Chanprapa Imjongjirak (Chulalongkorn University, 2000)
การทรานส์ฟอร์มรีพอร์ทเทอร์ยีนที่สร้างโปรตีนกรีนฟลูออเรสเซนต์ (GFP) เข้าสู่ข้าวพันธุ์ขาวดอกมะลิ 105 ทำได้โดยการเลี้ยงเอมบริโอเจนิคแคลลัส ที่ได้จากสคิวเทลลัมของเอมบริโอร่วมกับอะโกรแบคทีเรียม สายพันธุ์ Agrobacterium tumefaciens EHA105 ซึ่งมี pCAMBIA1301 (มียีนต้านยาไฮโกรไมซิน (hpt) เป็นยีนเครื่องหมาย และมีรีพอร์เทอร์ยีนคือยีนที่สร้าง GUS (uidA gene) pCAMBIA5305 (มียีน hpt เป็นยีนเครื่องหมาย และมีรีพอร์ทเทอร์ยีนคือยีนที่สร้างโปรตีนกรีนฟลูออเรสเซนต์ (GFP) และ pCAMBIA1306IC (มียีน hpt เป็นยีนเครื่องหมาย และมียีนที่สร้าง GUS และ GFP เป็นรีพอร์เทอร์ยีน) โดยยีนเหล่านี้ถูกควบคุมด้วยโปรโมเตอร์ CaMV35S จากการทดลองชักนำเมล็ดข้าวขาวดอกมะลิ 105 ให้เกิดเอมบริโอเจนิคแคลลัสบนอาหาร 2 สูตร คือ 2MS และ 2NB พบว่าสูตร 2NB สามารถชักนำให้เกิดเอมบริโอเจนิคแคลลัสได้ 79.2+-3.4% ในขณะที่ 2MS ชักนำให้เกิดได้ 54.6+-2.5% เมื่อนำแคลลัสที่ได้มาทำให้เกิดเป็นต้น โดยเปรียบเทียบอาหาร4 สูตร คือ MS1-RE NB1-RE NB2-RE และ NB4-RE พบว่า อาหารสูตร NB4-RE สามารถชักนำให้เกิดยอดได้ดีที่สุด คือ 68.2+-13.6% ในการทรานส์ฟอร์มโดยใช้อะโกรแบคทีเรียมเริ่มแรกได้นำอะโกรแบคทีเรียมที่มี pCAMBIA1301 มาเลี้ยงร่วมกับเอมบริโอเจนิคแคลลัสเป็นเวลา 3 วัน และตรวจสอบการทรานส์ฟอร์มโดยการแสดงออกของรีพอร์เทอร์ยีนที่สร้าง GUS พบว่ามีเปอร์เซนต์การทรานส์ฟอร์ม 15.8% และหลังจากเลี้ยงร่วมกันเป็นเวลา 3 วันแล้ว ได้นำแคลลัสลงเลี้ยงในอาหารที่มีไฮโกรไมซิน (50 mg/l) พบว่ามีแคลลัสที่สามารถต้านทานไฮโกรไมซินเกิดขึ้นหลังจาก 4 สัปดาห์ แคลลัสที่ไม่ได้เลี้ยงร่วมกับอะโกรแบคทีเรียมไม่สามารถเจริญได้ในอาหารที่มีไฮโกรไมซิน หลังจาก 8 สัปดาห์พบว่าเปอร์เซนต์การทรานส์ฟอร์มของแคลลัสที่สามารถเจริญได้ในไฮโกรไมซิน และมีการแสดงออกของรีพอร์เทอร์ยีนที่สร้าง GUS คือ 19.4% ในการทรานส์ฟอร์มรีพอร์เทอร์ยีนที่สร้าง GFP เข้าสู่ข้าวสามารถทำได้โดยใช้อะโกรแบคทีเรียมที่มี pCAMBIA5305 และ pCAMBIA1306IC มาเลี้ยงร่วมกับเอมบริโอเจนิคแคลลัสเป็นเวลา 3 วัน เช่นเดียวกัน แคลลัสที่ได้รับการทรานส์ฟอร์มรีพอร์เทอร์ยีนที่สร้าง GFP จะถูกชักนำให้เกิดเป็นต้นใหม่ การตรวจสอบการทรานสฟอร์มรีพอร์เทอร์ยีนที่สร้าง GFP เข้าสู่ข้าว ทำได้โดยตรวจการเรืองแสงของ GFP ในต้นข้าวและตรวจสอบยีนของ GFP ด้วยเทคนิคพีซีอาร์ พบว่าสามารถตรวจผลิตผลพีซีอาร์ได้ในทุกต้นของข้าวที่มีการเรืองแสงของ GFP และพบว่าประสิทธิภาพของการทรานส์ฟอร์มของอะโกรแบคทีเรียม เข้าสู่ต้นข้าวที่มีการแสดงออกของ GFP ที่ได้จากการทรานส์ฟอร์มด้วย pCAMBIA5305 และมีทั้งการแสดงออกของ GFP และการแสดงออกของรีพอร์เทอร์ยีนที่สร้าง GUS ที่ได้จากการทรานส์ฟอร์มด้วย pCAMBIA1306IC มีค่า 9.8% และ 8.2% ตามลำดับ