Nucleotide sequencing and cloning of alanine dehydrogenase gene from Aeromonas hydrophila - Natwadee Poomipark (Chulalongkorn University, 2000)
อะลานีนดีไฮโดรจิเนส [EC 1.4.1.1] เป็นเอนไซม์ในกลุ่มอะมิโนแอซิดดีไฮโดรจิเนส เร่งปฏิกิริยาการดึงหมู่อะมิโนจากอะลานีนให้ได้ผลิตภัณฑ์คือ ไพรูเวทและแอมโมเนีย ซึ่งเป็นปฏิกิริยาที่ผันกลับได้ ปัจจุบันได้มีการนำอะลานีนดีไฮโดรจิเนสมาตรวจสอบวิเคราะห์หาปริมาณอะลานีนและสารอนุพันธ์ รวมทั้งนำมาใช้ในอุตสาหกรรมยาและอาหาร การวิจัยก่อนหน้านี้ได้ทำการศึกษาอะลานีนดีไฮโดรจิเนสจาก Aeromonas hydrophila ซึ่งเป็นแบคทีเรียที่ทำการคัดเลือกจากดินในกรุงเทพฯ และพบว่าเอนไซม์นี้มีน้ำหนักโมเลกุล 230 กิโลดาลตัน ประกอบด้วย 6 หน่วยย่อยที่เหมือนกัน นอกจากนี้พบว่าลำดับกรดอะมิโนทางด้านปลาย N คือ MIIGVPKEIKHEYRVGM VPASVRELTARNHTVFVQSGAGN และลำดับกรดอะมิโนบางส่วนภายในสายโปรตีนคือ LAEQGYRNLLSDP HLRHGLNVMAGKK ซึ่งในงานวิจัยครั้งนี้ใช้เป็นข้อมูลพื้นฐานในการออกแบบไพรเมอร์เพื่อเพิ่มชิ้นยีนบางส่วนของอะลานีนดีไฮโดรจิเนสด้วยเทคนิคพีซีอาร์ โดยใช้โครโมโซมอลดีเอ็นเอที่ผ่านการย่อยด้วย EcoRI หรือ HindIII เป็นดีเอ็นเอต้นแบบ จากนั้นนำผลิตภัณฑ์จากพีซีอาร์ที่ได้ไปวิเคราะห์หาลำดับนิวคลีโอไทด์และนำมาเป็นข้อมูลออกแบบไพรเมอร์ในการเพิ่มชิ้นยีนส่วนที่ยังไม่ทราบลำดับนิวคลีโอไทด์ จากการวิเคราะห์หาลำดับนิวคลีโอไทด์พบว่า ชิ้นยีนอะลานีนดีไฮโดรจิเนสถอดรหัสพันธุกรรมของสายพอลิเปปไทด์ได้กรดอะมิโน 371 เรซิดิว ลำดับนิวคลีโอไทด์ของยีนอะลานีนดีไฮโดรจิเนส บริเวณปลายด้าน N และ C ได้ถูกนำมาออกแบบไพรเมอร์เพื่อทำการเพิ่มชิ้นยีนทั้งชิ้นและโคลนเข้าสู่ E.coil JM109 เมื่อวิเคราะห์สารละลายเอนไซม์ที่ได้จากเซลล์ E.coli JM109 ซึ่งได้รับชิ้นยีนอะลานีนดีไฮโดรจิเนสพบว่า เอนไซม์มีค่าแอคติวิตีจำเพาะอยู่ในช่วง 0-10 ยูนิต/มิลลิกรัมโปรตีน โดยโคลนที่มีแอคติวิตีสูงที่สุดจะมีค่าแอคติวิตีจำเพาะสูงกว่าสารละลายเอนไซม์จาก Aeromonas hydrophila ประมาณ 50 เท่า