Screening and cloning of crystalline chitin degrading chitinase gene - Supida Tubtimthep (Chulalongkorn University, 2001)
แบคทีเรียที่ผลิตเอนไซม์ไคติเนสคัดเลือกมาจากตัวอย่างดินจากแหล่งต่าง ๆ ของประเทศไทยคือ อำเภอมหาชัย จังหวัดสมุทรสาคร อำเภอพัทยา จังหวัดชลบุรี เกาะพีพี จังหวัดกระบี่ และ อำเภอจุกกะเฌอ จังหวัดฉะเชิงเทรา นำแบคทีเรียที่คัดเลือกได้นี้มาเลี้ยงและผลิตไคติเนสโดยวัดการทำงานของไคติเนสกับสับสเตรตไคติน 2 ชนิด คือ powdered chitin และ colloidal chitin โดยวิธี colorimetric method แล้วคำนวณค่าการทำงานของไคติเนสเป็นเปอร์เซนต์สัดส่วนแอคติวิตี้ต่อ powdered chitin กับ แอคติวิตี้ต่อ colloidal chitin ซึ่งสามารถแบ่งแบคทีเรียออกเป็น 5 กลุ่ม โดยกลุ่มที่ 1 คือ แบคทีเรียที่ไม่สามารถย่อย powdered chitin ได้ กลุ่มที่ 2 ถึง กลุ่มที่ 5 คือแบคทีเรียที่มีสัดส่วนของแอคติวิตี้ต่อ powdered chitin กับ colloidal chitin ตังแต่ 10% จนถึงมากกว่า 40% ในงานวิจัยนี้ได้เลือกใช้ Bacillus circulans PP8 ซึ่งเป็นสมาชิกของแบคทีเรียในกลุ่มที่ 5 ซึ่งมีค่าสัดส่วนแอคติวิตี้มากกว่า 40 % Bacillus circulans PP8 ผลิตเอนไซม์ที่ย่อยไคทินที่มีระเบียบ โดยสามารถย่อยได้ทัง powdered chitin, colloidal chitin, และ chitosan (100 % deacetylated) เมื่อเลี้ยงในอาหาร colloidal chitin minimum medium พบไคทิเนสแอคติวิตี้สูงสุดทีชั่วโมงที่ 12 (ChiA) เมื่อใช้ colloidal chitin เป็นสับสเตรต และชั่วโมงที่ 24 (ChiB) เมือใช้ powdered chitin เป็นสับสเตรต จากนั้นแอคติวิตี้ของไคติเนสจะค่อย ๆ ลดลงและหายไปหลังจากชั่วโมงที่ 48 พบไคโตซานเนสแอคติวิตี้หลังจากชั่วโมงที่ 60 และแอคติวิตี้สูงสุดที่ชั่วโมงที่ 84 สภาวะความเป็นกรดด่างที่เหมาะสมต่อการทำงานของเอนไซม์ ChiA, ChiB และ ไคโตซานเนส คือ 7.0/50℃, 6.0/30℃ และ 7.0/60℃ ตามลำดับ โครโมโซมอลดีเอ็นเอของ Bacillus circulans PP8 ซึ่งตัดด้วย PstI ขนาด 2-9 กิโลเบส ถูกโคลนเข้าสู่ E.coli สายพันธ์ DH5α ด้วยวิธี Shot gun โดยมี pBluescript SK เป็นดีเอ็นเอพาหะ หลังจากคัดเลือก transformants เป็นจำนวน 1,800 โคโลนี พบ 2 โคโลนีที่สามารถสร้างวงใสรอบโคโลนีเมื่อเลี้ยงในอาหาร colloidal chitin